色譜儀的基礎(chǔ)知識

1、色譜起源

2、色譜定義

色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進行分離的技術(shù)

流動相：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體

固定相：靜止不動的一相，色譜柱

色譜是一種分離技術(shù).

色譜的主要目的是對混合物中的目標物分離和定量

3、色譜分類

1、高效液相色譜 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

2、氣相色譜 Gas Chromatography (GC)

3、薄層色譜 Thin-Layer Chromatography (TLC)

4、毛細管電泳 Capillary Electrophoresis(CE)

4、色譜優(yōu)點

1、同時分析

2、分離性能好

3、靈敏度高 (ppm-ppb)

4、進樣量小 (1-100uL)

HPLC vs GC

液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法

1、適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析

2、流動相具有運載樣品分子和選擇性分離的雙重作用

氣相色譜：以氣體作為流動相的色譜分離方法

1、適用于沸點較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析

2、流動相只起運載樣品分子的能力

5、HPLC分類

1、正相模式 (NP-LC)

2、反相模式 (RP-LC)

3、反相離子對色譜 (IPC)
4、離子交換色譜 (IEC)

5、尺寸排阻色譜 (GPC / GFC)

反相模式 (RP)

填料：C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基

相互作用力：

反相模式下流動相的選擇：

優(yōu)化水相（緩沖液）和有機相的比例非常重要（甲醇，乙腈和 THF 是常用的有機溶劑）

在有緩沖液的情況下, 緩沖液的濃度和pH值非常重要

增加流動相極性：

固定相極性變化對分離的影響：

固定相極性變化對分離的影響：

離子對色譜

離子對試劑

•陰離子化合物：氫氧化四丁基銨、溴化四丁基銨

•陽離子化合物：丁烷基磺酸鈉(C4)、戊烷基磺酸鈉(C5)、己烷基磺酸鈉(C6）、庚烷基磺酸鈉(C7)、辛烷基磺酸鈉(C8)、癸烷基磺酸鈉(C10)、十二烷基磺酸鈉(SDS)

離子對色譜影響因素

•離子對試劑的類型

•離子對試劑的濃度

•流動相的pH

正相色譜

色譜柱：

•硅膠柱:常用

•氰基柱: 常用

•氨基柱: 分析糖

•二醇基柱: 分析蛋白質(zhì)

相互作用力

氫鍵力

•如果樣品有

–-COOH: 羧基

–-NH2: 氨基

–-OH: 羥基

則氫鍵力強.

•如果樣品沒有任何官能團，象碳水化合物

•如果樣品有大的基團, 由于空間障礙

則氫鍵力弱.

正相模式下流動相的選擇：

•主要試劑：烷烴(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烴(苯, 甲苯, 二甲苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳

•輔助試劑：甲基-t-丁基醚(MTBE)、四氫呋喃(THF)、二氧雜環(huán)乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、異丙醇、乙醇、甲醇

為了調(diào)整保留時間，可以選擇主要試劑然后再加入輔助試劑。

增加流動相極性：

反相色譜與正相色譜的對比：

反相：保留時間重復(fù)性好、固定相耐用

正相：對立體異構(gòu)體有很好的分離(Vitamin E等)、保留時間重復(fù)性稍差

離子交換色譜：

離子交換色譜應(yīng)用：

生物領(lǐng)域(蛋白質(zhì), 農(nóng)藥, 氨基酸分析)

離子分析

陽離子交換劑：強陽離子交換劑(SCX)(R-SO3-)

弱陽離子交換劑(WCX) (R-COO-)

陰離子交換劑：強陰離子交換劑(SAX) (R4N+)

弱陰離子交換劑(WAX)(DEAE)

尺寸排阻色譜法（SEC）

**部分 柱子基本性能參數(shù)

1、表征色譜柱的參數(shù)

硅膠純度：填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度。

色譜柱尺寸：填料床的長度和內(nèi)徑。

顆粒形狀：球型或不規(guī)則型。

粒徑：平均顆粒直徑,通常3-10μm。

表面積：顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/g表示。

孔徑：顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300Å。

碳百分率：與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量。

封尾：用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來。

2、表征色譜柱性能的參數(shù)

（1）容量因子, k'

（2）理論塔板數(shù), N

（3）分離度, Resolution

完全分離時的分離度

（4）拖尾因子，T

第三部分 HPLC硬件基礎(chǔ)知識

1、液相色譜簡易流程圖

2、流動相的選擇

（1）采用“HPLC”級溶劑

（2）避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑

（3）對試樣有適宜的溶解度

（4）溶劑粘度要小

（5）與檢測器相匹配

水的等級

HPLC用水可以通過以下幾個方法得到：

（1）專門的純水機或超純水機:理想的HPLC用水應(yīng)為18.2MΩ的超純水，并通過0.22μm的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子等。

（2）去離子水重蒸；

（3）二次或三次重蒸水；

不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水。

有機溶劑的等級

應(yīng)選用HPLC級的有機溶劑。

緩沖鹽

選擇緩沖液的步驟：

1、確定*佳分離狀態(tài)時的流動相pH

2、選擇具有與流動相pH相近的pKa的緩沖液（即使?jié)舛认∫簿哂休^強能力的緩沖液）

3、確認檢測波長下緩沖液是否有大的吸收（在波長210nm附近進行檢測時，不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）

緩沖液的使用：

（1）使用前必須過濾。

（2）使用后一定要進行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:用含5%甲醇 的水溶液沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min。

（3）用純水沖洗泵頭清洗管路。

（4）易受到**和霉菌的影響。

流動相的更換

不互溶的流動相不能直接更換，緩沖鹽不能直接用有機溶劑更換

溶劑的黏度

（1）乙腈黏度低在相同流速時有較低的柱壓。

（2）當和水混合時黏度有變化柱壓也相應(yīng)有變化。

溶劑前處理

過濾

過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液時。

濾膜類型：

聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。

醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶劑。

尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可以用于強酸，不適用于二甲基甲酰胺。

再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑。

脫氣

脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對測定的影響：

（1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積

（2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

（3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動

脫氣方法：

1、超聲脫氣

2、減壓脫氣

3、在線脫氣

3、樣品前處理

（1）使用流動相溶解樣品

--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時尤為重要

--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中，

尤其在柱中產(chǎn)生沉淀

（2）進樣前**使用0.45um 的濾膜進行過濾，

如果樣品很臟，要使用0.22um的濾膜進行過濾。

（3）對于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，**前處理后再進樣。

4、進樣

（1）進樣器

•自動進樣器

•手動進樣器原理：（六通閥）注入方式：1）全量注入2）部分注入

（2）手動進樣器的原理圖

•部分注入：一般要求進樣量*多為定量環(huán)體積的一半，如20μl的定量環(huán)*多進樣10μl的樣品，并且要求每次進樣體積準確、相同。

•全量注入：進樣量*少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)*少進樣60至100μl的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達到所要求的精密度及重現(xiàn)性。

5、洗脫

（1）等度洗脫

（2）梯度洗脫

使用梯度洗脫的原因：

梯度洗脫要點：

梯度洗脫：

優(yōu)點：可提高分離度、縮短分離時間、降低*小檢測量和提高分離精度

注意事項：

（1）溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差。

（2）梯度混合的溶劑互溶性要好。

（3）梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如

紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變

化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）。

（4）查看空白實驗的數(shù)據(jù)。

（5）遵守分析周期（*初的分析數(shù)據(jù)不采用）。

6、色譜柱的類型及適用范圍

7、分析柱的維護

1、在使用新柱之前，**用強溶劑在低流量下(0.2-0.3 ml/min)沖洗30 min，長時間未用的分析柱也要同樣處理。

2、定期使用強溶劑沖洗柱子。

3、使用緩沖鹽時，要先用含5%甲醇的水溶液沖洗，再用有機溶劑沖洗。

4、凈化樣品。

5、分離條件。

6、不使用時，要蓋上蓋子，避免固定相干涸。

8、常用檢測器

（1）紫外檢測器（包括二極管陣列檢測器）

（2）熒光檢測器

（3）示差折光檢測器

（4）電導檢測器

（5）蒸發(fā)光散射檢測器

（6）質(zhì)譜檢測器